摘要：大阪城市大學(xué)的科學(xué)家在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)沙姜的抗癌作用
沙姜雞、沙姜豬手、沙姜豬肚。。。美食愛好者們應(yīng)該知道它是一種芳香調(diào)料，可以為菜肴增添特殊風(fēng)味，或者是一種舒緩胃部不適的草藥，但大阪城市大學(xué)的研究人員從中發(fā)現(xiàn)了令人鼓舞的新信息：沙姜的主要活性成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate，EMC）具有抗癌作用。在人類生命與生態(tài)研究生院副教授小島明子(Akiko Kojima)的帶領(lǐng)下，研究人員證明，沙姜提取物及其主要活性成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(EMC)在細(xì)胞和動(dòng)物水平上顯著抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并揭示了EMC通過降低與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (TFAM)的表達(dá)而具有抗癌潛力的機(jī)制。
“這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)了沙姜根莖提取物(KGE)及其主要活性成分EMC的抗癌作用。Kojima教授表示:“隨著相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，TFAM有望成為抗癌效果的新標(biāo)記物?！彼麄兊难芯拷Y(jié)果發(fā)表在《Heliyon》雜志上。
圖1 沙姜根莖提取物(KGE)及其主要活性成分EMC的抗癌作用
背景
無論是發(fā)達(dá)國(guó)家或者發(fā)展中國(guó)家，癌癥都是一個(gè)日益嚴(yán)重的健康問題和主要的致死原因之一。植物中含有許多生物活性化合物——黃酮類、酚酸類、單寧類、生物堿類、萜類等植物天然化合物具有抗癌作用，從這些天然活性化合物中開發(fā)出具有抗癌效力但不影響其他細(xì)胞活力的新型化療藥物一直是研究熱點(diǎn)。
山柰良姜（Kaempferia galanga L. 沙姜）是姜科的一種單子葉植物，用作香料和草藥，其根莖提取物(KGE)具有多種生理作用，包括抗氧化和抗炎作用。既往研究報(bào)道，腹腔注射KGE可使接種了艾氏腹水瘤細(xì)胞(Ehrlich ascites tumor cells, EATCs)的小鼠腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，壽命延長(zhǎng)。KGE中的主要活性成分是對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate，EMC）占KGE乙醇提取物(70%) 的8成以上，其生理作用包括抗炎作用、抗氧化作用、殺菌作用等。高濃度的EMC不僅能抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌Ca992細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了避免EMC的毒性作用，有必要在低濃度下評(píng)估其抗癌作用和對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖2 EMC化學(xué)結(jié)構(gòu)式
研究亮點(diǎn)
該研究通過靶向乳腺癌來源的EATCs中的TFAM，首次闡明了KGE和EMC對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞(EATCs)的抗癌作用的詳細(xì)機(jī)制。在小鼠腫瘤模型中，經(jīng)腹腔給藥的EATC也證實(shí)了KGE和EMC的抗癌作用。
1. 沙姜根莖提取物KGE和主成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯EMC對(duì)小鼠體重和腹水容量的影響
在小鼠腫瘤模型中研究了KGE和EMC的抗癌作用。腹腔注射EATC可迅速增加小鼠腹水，腹水體積是抗癌效果的指標(biāo)之一。EATC(+)對(duì)照組小鼠的體重和腹水體積相比較EATC(-)對(duì)照組小鼠顯著增加，口服EMC和KGE可抑制腹水體積的增加。EMC(66 mg/kg體重)處理的腹水體積明顯減少，KGE(80 mg/kg體重)處理有減少腹水體積的趨勢(shì)，但不如EMC。經(jīng)HPLC分析證實(shí)80mg KGE中含有66mg EMC。KGE治療的腹水體積減少量低于EMC治療的原因尚不清楚。
2. KGE和EMC對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞EATC和正常細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞活力和增殖的影響
采用臺(tái)盼藍(lán)法觀察KGE對(duì)處理24 h后EATCs細(xì)胞活力和增殖的影響。KGE(0?25 μg/ml)沒有顯著改變細(xì)胞活力，但呈劑量依賴性地減少癌細(xì)胞數(shù)量。KGE(0?25 μg/ml)對(duì)正常細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞的存活率和細(xì)胞數(shù)量沒有顯著影響， KGE對(duì)EATC細(xì)胞和正常細(xì)胞的LC50分別為54.07和173.33 μg/ml, SI為3.21——高SI值表明該物質(zhì)對(duì)癌細(xì)胞的毒性大于對(duì)正常細(xì)胞的毒性，這意味著它可能具有抗癌劑的潛力。結(jié)果表明，KGE可能對(duì)EATC具有抗增殖作用，但對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性小。
根據(jù)市售KGE中的EMC濃度，計(jì)算出在25 μg/ml KGE作用下，EMC濃度為100 μM。采用臺(tái)盼藍(lán)法觀察法表明，EMC (0-100 μM)沒有顯著降低EATC活力，但呈濃度依賴性地降低了細(xì)胞數(shù)量。EMC (0-100 μM)對(duì)正常細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)量基本無影響。EMC對(duì)EATC和正常細(xì)胞的LC50分別為387.66和759.50 μM, SI為1.96。這表明低劑量(100 μM)的EMC能抑制細(xì)胞增殖，具有安全的抗癌作用。
3. KGE和EMC對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞EATCs DNA合成的影響
用BrdU法研究了KGE對(duì)DNA合成的影響。BrdU被用于標(biāo)記S期細(xì)胞，因?yàn)樗赟期整合到新合成的DNA中。經(jīng)KGE處理后，BrdU陽性的EATC數(shù)量顯著減少。結(jié)果表明，KGE抑制了EATCs的S期進(jìn)展。EMC處理同樣顯著降低了BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果與在KGE處理的細(xì)胞中觀察到的結(jié)果相似。
4. KGE和EMC對(duì)EATCs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響
細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期調(diào)控。癌細(xì)胞通常具有異常的細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞缺乏分化和不受調(diào)控的增殖。既往報(bào)道表明在超過90%的人類癌癥中觀察到細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的致癌改變，并且經(jīng)常發(fā)生在G1期。Cyclin D1的表達(dá)對(duì)于推動(dòng)細(xì)胞從G1期到S期的進(jìn)展很重要——在與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)形成復(fù)合物后推動(dòng)從G1期到S期的進(jìn)程。Cyclin D1在人類惡性腫瘤中的表達(dá)水平升高。相反，眾所周知的抗癌因子p21通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4/6復(fù)合物而導(dǎo)致G1細(xì)胞周期阻滯。
使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KGE和EMC對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，與KGE或EMC孵育EATCs后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增加。S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯減少。KGE或EMC阻斷了細(xì)胞周期中的S期進(jìn)程。為了闡明EMC阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制，研究人員測(cè)量了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在EATCs中的表達(dá)水平。EMC處理顯著降低了Cyclin D1的表達(dá)。相比之下，EMC處理后p21表達(dá)顯著增加。
5. EMC對(duì)EATCs中TFAM表達(dá)、mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位的影響
為了進(jìn)一步研究EMC抗增殖作用的機(jī)制，研究人員測(cè)量了EATCs中TFAM mRNA和蛋白的表達(dá)水平。EMC處理顯著降低了TFAM mRNA和蛋白的表達(dá)水平。他們還評(píng)估了EMC對(duì)mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位的影響——這是線粒體功能的一個(gè)指標(biāo)。EMC對(duì)mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位沒有顯著影響。
6. EMC對(duì)EATCs中H-ras mRNA表達(dá)水平和c-myc Ser62位點(diǎn)磷酸化的影響
癌基因c-Myc作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種生物過程的基因中起著關(guān)鍵作用。c-Myc通過結(jié)合核DNA編碼的TFAM啟動(dòng)子區(qū)直接誘導(dǎo)TFAM表達(dá)。合成的c-Myc由于半衰期短而不穩(wěn)定；但Ras介導(dǎo)的Ser62殘基的磷酸化可增加其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。Ras由H-ras、K-ras和N-ras亞型組成，被激活后能誘導(dǎo)c-Myc的Ser62位點(diǎn)磷酸化并提高其轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步研究表明，EMC顯著抑制H-ras mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制c-Myc Ser62位點(diǎn)的磷酸化、抑制c-Myc 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制TFAM的表達(dá)。EMC調(diào)控H-ras mRNA表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
總結(jié)：
KGE和EMC通過阻斷G1/S相轉(zhuǎn)變抑制腫瘤細(xì)胞增殖。EMC通過上調(diào)p21和下調(diào)Cyclin D1表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。EMC還會(huì)降低線粒體功能調(diào)節(jié)劑TFAM的表達(dá)。有趣的是，盡管TFAM表達(dá)水平降低，但EMC并未誘導(dǎo)線粒體功能障礙，未見mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位減少。這些結(jié)果表明，下調(diào)TFAM可能是通過調(diào)節(jié)核基因的表達(dá)抑制EATC的增殖，而不是誘導(dǎo)線粒體功能障礙。這是首次報(bào)告天然化合物誘導(dǎo)的TFAM表達(dá)下降與Cyclin D1和p21的表達(dá)水平相關(guān)。
由于癌細(xì)胞表現(xiàn)出不受控制的增殖和對(duì)周圍正常組織的損害。因此，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要手段。EMC將有潛力成為一種新的輔助化療試劑進(jìn)一步研究。
摘要：大阪城市大學(xué)的科學(xué)家在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)沙姜的抗癌作用
沙姜雞、沙姜豬手、沙姜豬肚。。。美食愛好者們應(yīng)該知道它是一種芳香調(diào)料，可以為菜肴增添特殊風(fēng)味，或者是一種舒緩胃部不適的草藥，但大阪城市大學(xué)的研究人員從中發(fā)現(xiàn)了令人鼓舞的新信息：沙姜的主要活性成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate，EMC）具有抗癌作用。在人類生命與生態(tài)研究生院副教授小島明子(Akiko Kojima)的帶領(lǐng)下，研究人員證明，沙姜提取物及其主要活性成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(EMC)在細(xì)胞和動(dòng)物水平上顯著抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并揭示了EMC通過降低與癌細(xì)胞增殖相關(guān)的線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (TFAM)的表達(dá)而具有抗癌潛力的機(jī)制。
“這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)了沙姜根莖提取物(KGE)及其主要活性成分EMC的抗癌作用。Kojima教授表示:“隨著相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，TFAM有望成為抗癌效果的新標(biāo)記物。”他們的研究結(jié)果發(fā)表在《Heliyon》雜志上。
圖1 沙姜根莖提取物(KGE)及其主要活性成分EMC的抗癌作用
背景
無論是發(fā)達(dá)國(guó)家或者發(fā)展中國(guó)家，癌癥都是一個(gè)日益嚴(yán)重的健康問題和主要的致死原因之一。植物中含有許多生物活性化合物——黃酮類、酚酸類、單寧類、生物堿類、萜類等植物天然化合物具有抗癌作用，從這些天然活性化合物中開發(fā)出具有抗癌效力但不影響其他細(xì)胞活力的新型化療藥物一直是研究熱點(diǎn)。
山柰良姜（Kaempferia galanga L. 沙姜）是姜科的一種單子葉植物，用作香料和草藥，其根莖提取物(KGE)具有多種生理作用，包括抗氧化和抗炎作用。既往研究報(bào)道，腹腔注射KGE可使接種了艾氏腹水瘤細(xì)胞(Ehrlich ascites tumor cells, EATCs)的小鼠腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，壽命延長(zhǎng)。KGE中的主要活性成分是對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(Ethyl p-methoxycinnamate，EMC）占KGE乙醇提取物(70%) 的8成以上，其生理作用包括抗炎作用、抗氧化作用、殺菌作用等。高濃度的EMC不僅能抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌Ca992細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了避免EMC的毒性作用，有必要在低濃度下評(píng)估其抗癌作用和對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
圖2 EMC化學(xué)結(jié)構(gòu)式
研究亮點(diǎn)
該研究通過靶向乳腺癌來源的EATCs中的TFAM，首次闡明了KGE和EMC對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞(EATCs)的抗癌作用的詳細(xì)機(jī)制。在小鼠腫瘤模型中，經(jīng)腹腔給藥的EATC也證實(shí)了KGE和EMC的抗癌作用。
1. 沙姜根莖提取物KGE和主成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯EMC對(duì)小鼠體重和腹水容量的影響
在小鼠腫瘤模型中研究了KGE和EMC的抗癌作用。腹腔注射EATC可迅速增加小鼠腹水，腹水體積是抗癌效果的指標(biāo)之一。EATC(+)對(duì)照組小鼠的體重和腹水體積相比較EATC(-)對(duì)照組小鼠顯著增加，口服EMC和KGE可抑制腹水體積的增加。EMC(66 mg/kg體重)處理的腹水體積明顯減少，KGE(80 mg/kg體重)處理有減少腹水體積的趨勢(shì)，但不如EMC。經(jīng)HPLC分析證實(shí)80mg KGE中含有66mg EMC。KGE治療的腹水體積減少量低于EMC治療的原因尚不清楚。
2. KGE和EMC對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞EATC和正常細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞活力和增殖的影響
采用臺(tái)盼藍(lán)法觀察KGE對(duì)處理24 h后EATCs細(xì)胞活力和增殖的影響。KGE(0?25 μg/ml)沒有顯著改變細(xì)胞活力，但呈劑量依賴性地減少癌細(xì)胞數(shù)量。KGE(0?25 μg/ml)對(duì)正常細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞的存活率和細(xì)胞數(shù)量沒有顯著影響， KGE對(duì)EATC細(xì)胞和正常細(xì)胞的LC50分別為54.07和173.33 μg/ml, SI為3.21——高SI值表明該物質(zhì)對(duì)癌細(xì)胞的毒性大于對(duì)正常細(xì)胞的毒性，這意味著它可能具有抗癌劑的潛力。結(jié)果表明，KGE可能對(duì)EATC具有抗增殖作用，但對(duì)正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性小。
根據(jù)市售KGE中的EMC濃度，計(jì)算出在25 μg/ml KGE作用下，EMC濃度為100 μM。采用臺(tái)盼藍(lán)法觀察法表明，EMC (0-100 μM)沒有顯著降低EATC活力，但呈濃度依賴性地降低了細(xì)胞數(shù)量。EMC (0-100 μM)對(duì)正常細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)量基本無影響。EMC對(duì)EATC和正常細(xì)胞的LC50分別為387.66和759.50 μM, SI為1.96。這表明低劑量(100 μM)的EMC能抑制細(xì)胞增殖，具有安全的抗癌作用。
3. KGE和EMC對(duì)艾氏腹水瘤細(xì)胞EATCs DNA合成的影響
用BrdU法研究了KGE對(duì)DNA合成的影響。BrdU被用于標(biāo)記S期細(xì)胞，因?yàn)樗赟期整合到新合成的DNA中。經(jīng)KGE處理后，BrdU陽性的EATC數(shù)量顯著減少。結(jié)果表明，KGE抑制了EATCs的S期進(jìn)展。EMC處理同樣顯著降低了BrdU陽性細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果與在KGE處理的細(xì)胞中觀察到的結(jié)果相似。
4. KGE和EMC對(duì)EATCs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響
細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期調(diào)控。癌細(xì)胞通常具有異常的細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞缺乏分化和不受調(diào)控的增殖。既往報(bào)道表明在超過90%的人類癌癥中觀察到細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的致癌改變，并且經(jīng)常發(fā)生在G1期。Cyclin D1的表達(dá)對(duì)于推動(dòng)細(xì)胞從G1期到S期的進(jìn)展很重要——在與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)形成復(fù)合物后推動(dòng)從G1期到S期的進(jìn)程。Cyclin D1在人類惡性腫瘤中的表達(dá)水平升高。相反，眾所周知的抗癌因子p21通過抑制細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4/6復(fù)合物而導(dǎo)致G1細(xì)胞周期阻滯。
使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KGE和EMC對(duì)細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，與KGE或EMC孵育EATCs后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量增加。S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量明顯減少。KGE或EMC阻斷了細(xì)胞周期中的S期進(jìn)程。為了闡明EMC阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制，研究人員測(cè)量了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在EATCs中的表達(dá)水平。EMC處理顯著降低了Cyclin D1的表達(dá)。相比之下，EMC處理后p21表達(dá)顯著增加。
5. EMC對(duì)EATCs中TFAM表達(dá)、mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位的影響
為了進(jìn)一步研究EMC抗增殖作用的機(jī)制，研究人員測(cè)量了EATCs中TFAM mRNA和蛋白的表達(dá)水平。EMC處理顯著降低了TFAM mRNA和蛋白的表達(dá)水平。他們還評(píng)估了EMC對(duì)mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位的影響——這是線粒體功能的一個(gè)指標(biāo)。EMC對(duì)mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位沒有顯著影響。
6. EMC對(duì)EATCs中H-ras mRNA表達(dá)水平和c-myc Ser62位點(diǎn)磷酸化的影響
癌基因c-Myc作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種生物過程的基因中起著關(guān)鍵作用。c-Myc通過結(jié)合核DNA編碼的TFAM啟動(dòng)子區(qū)直接誘導(dǎo)TFAM表達(dá)。合成的c-Myc由于半衰期短而不穩(wěn)定；但Ras介導(dǎo)的Ser62殘基的磷酸化可增加其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。Ras由H-ras、K-ras和N-ras亞型組成，被激活后能誘導(dǎo)c-Myc的Ser62位點(diǎn)磷酸化并提高其轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步研究表明，EMC顯著抑制H-ras mRNA表達(dá)，進(jìn)而抑制c-Myc Ser62位點(diǎn)的磷酸化、抑制c-Myc 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制TFAM的表達(dá)。EMC調(diào)控H-ras mRNA表達(dá)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
總結(jié)：
KGE和EMC通過阻斷G1/S相轉(zhuǎn)變抑制腫瘤細(xì)胞增殖。EMC通過上調(diào)p21和下調(diào)Cyclin D1表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。EMC還會(huì)降低線粒體功能調(diào)節(jié)劑TFAM的表達(dá)。有趣的是，盡管TFAM表達(dá)水平降低，但EMC并未誘導(dǎo)線粒體功能障礙，未見mtDNA拷貝數(shù)和線粒體膜電位減少。這些結(jié)果表明，下調(diào)TFAM可能是通過調(diào)節(jié)核基因的表達(dá)抑制EATC的增殖，而不是誘導(dǎo)線粒體功能障礙。這是首次報(bào)告天然化合物誘導(dǎo)的TFAM表達(dá)下降與Cyclin D1和p21的表達(dá)水平相關(guān)。
由于癌細(xì)胞表現(xiàn)出不受控制的增殖和對(duì)周圍正常組織的損害。因此，抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要手段。EMC將有潛力成為一種新的輔助化療試劑進(jìn)一步研究。
